Виды томата, отличающиеся окраской плода, были использованы как модель для изучения каротиногенеза в сочных плодах, в частности, роли  15-цис-ζ-каротинизомеразы Z-ISO. У 12 сортов S. lycopersicum и 5 видов дикорастущих видов томата с разной окраской зрелого плода  идентифицировали гены-гомологи Z-ISO, включая 5′-UTR и промотор. Гомологи Z-ISO имели высоко консервативную структуру, что позволяет предположить аналогичную функцию Z-ISO у видов томата, несмотря на различия в окраске плода. Уровни транскрипции Z-ISO положительно коррелировали с содержанием каротиноидов в спелом плоде томата. Анализ последовательностей промотора и 5′-UTR Z-ISO выявил более 130 цис-регуляторных элементов и значительные различия у видов с зелеными и красными/желтыми плодами, что указывает на изменения в регуляции экспрессии Z-ISO во время эволюции видов томата.

The post Characterization of 15-cis-ζ-Carotene Isomerase Z-ISO in Cultivated and Wild Tomato Species Differing in Ripe Fruit Pigmentation first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.

С целью исследования функций пластидной крахмал-фосфорилазы в клубнях картофеля, в том числе в условиях холодового стресса,  использована система CRISPR-Cas9 для редактирования гена PHO1a в четырех сортах картофеля, что привело к введению радикальной мутации G261V в функциональный домен. Мутанты имели измененную морфологию и отличались содержанием крахмала в корнях и листьях. Воздействие холодового стресса выявило дифференциальную реакцию родительских и трансгенных растений по содержанию крахмала и экспрессии генов углеводного обмена. Это позволяет предположить, что мутация G261V вызывает изменения функциональной активности PHO1a, которые, в свою очередь, влияют на скоординированную работу ферментов катаболизма крахмала как в нормальных условиях, так и стрессовых условия, а также подчеркивают критическую регулирующую роль PHO1a в метаболизме крахмала, развитии корней и побегов, а также в реакции на стресс у картофеля.

The post Effect of a Radical Mutation in Plastidic Starch Phosphorylase PHO1a on Potato Growth and Cold Stress Response first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.

Идентифицированы и охарактеризованы полные последовательности локуса RIN-MC у видов томата, различающихся характеристиками спелого плода. Определена транскрипция двух изоформ RIN1 и RIN2, а также химерного фрагмента RIN-MC. Показано белковое взаимодействие RIN1 и RIN2 с RIN-партнерами, при этом только RIN1 активировал транскрипцию репортерных генов, что согласуется с положительной корреляцией между экспрессией генов-мишеней RIN и RIN1i. Предполагается наличие связи между модификациями гена RIN и его белкового продукта и различием в созревании плода диких зеленоплодных видов томата и красноплодных образцов S. lycopersicum. Выявленная вариабельность промотора RIN-индуцируемых генов могла быть одним из движущих факторов в эволюции признака окраски плода при переходе от зеленоплодных к красноплодным видам томата.

The post Characterization of RIN Isoforms and Their Expression in
Tomato Fruit Ripening first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.

Введение динамического контроля экспрессии целевых генов в зависимости от изменяющегося в процессе культивирования организма метаболического статуса клетки является выдающимся достижением современной метаболической инженерии, при котором индуцибельная конвергентная транскрипция является одним из привлекательных способов условного подавления работы желаемых генов. В данной работе для реализации этих целей вместо простого сильного «реверсивного» (конвергентного) (r-) промотора предлагается использовать более сложные трех-компонентные генетические элементы для осуществления подавления работы целевого гена. Эти первоначально конститутивные элементы, состоявшие из традиционных r-промоторов различной силы, состыкованных с сайт-специфическим рибосомальным анти-терминатором транскрипции — rrnG-AT и сайтом процессинга РНказойIII, располагались 3’-концевой нетранслируемой области трех хорошо известных метаболических генов E.coli gltA, pgi, и ppc. При этом подчеркнем, что вторые и третьи компоненты этих новых элементов были существенны для значительного повышения надежности достигаемого эффекта подавления «сысловой» транскрипции целевого гена за счет интерференции с «конвергентной». Максимальные эффекты подавления для тестированных генов при использовании наиболее сильных r-промоторов были, соответственно 7, 11 и более 100 раз. Использование наиболее простой математической модели процесса, предполагающей, что интерференция полностью обусловлена результатом столкновения двух молекул, конвергентно двигающихся РНК полимераз, при котором только одна молекула сможет продолжить процесс транскрипции, позволило достоверно показать следующее. Если при использовании стандартной процедуры подавления с помощью r-промотора f-РНК полимераза, сопровождаемая движущимися по мРНК рибосомами, диссоциирует в результате столкновения в 13 раз реже, чем r-РНК полимераза, то введение модифицированного r-элемента увеличивает эффективность подавления как минимум в 3-4 раза. Тем самым проведенная модификация существенно повышает возможность направленного ослабления транскрипции целевого гена, предотвращая возможную Rho-зависимую терминацию транскрипции нетранслируемой конвергентной РНК.

The post Universal Actuator for Efficient Silencing of Escherichia coli Genes Based on Convergent Transcription Resistant to Rho-Dependent Termination first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.

Описана разработка нового метода редактирования генома важных промышленных микроорганизмов Corynebacterium glutamicum за счет возможной последовательной интеграции в выбранные по желанию исследователя точки генома достаточно протяженных фрагментов рекомбинантной ДНК. Данный подход идеологически основан на разработанной авторами ранее экспериментальной стратегии модификации генома E. coli, названной Dual-In/Out strategy Minaeva et al., 2008) и использующей комбинацию различных рекомбинационных методов in vitro и in vivo с последовательным объединением различных возможных модификаций в геноме одного штамма, не содержащего в итоге ни автономно реплицирующихся бактериальных плазмид, ни маркеров устойчивости к антибиотикам, в соответствии с современными требованиями к штаммам, допустимым к использованию в микробиологическом промышленном производстве. Разработанная стратегия основана на: 1) общей RecE564/RecT-зависимой системе рекомбинации E. coli Rac профага; 2) двух системах сайт-специфической рекомбинации — (Int/Xis)-зависимой системы умеренного коринефага ϕ16  и (Cre/lox)- зависимой системы колифага Р1; 3) разработанном протоколе электротрансформации штаммов C. glutamicum препаратами выделенных бактериальных хромосом для объединения различных проведенных в разных штаммах модификаций в конечном итоге в одном штамме. В работе показано, что для каждого из исследованных штаммов C. glutamicum вероятность переноса различных модификаций электротрансформацией  значительно варьирует (до двух порядков величины), по-видимому, из-за различной рекомбинационной доступности соответствующих участков бактериальной хромосомы. Чтобы обойти эту сложность, первоначально предлагалось использовать технологию Mu –зависимой транспозиции для предварительной селекции участков бактериальной хромосомы, которые в логарифмически растущей бактериальной культуре находятся в компетентном состоянии для эффективной интеграции гетерологичной ДНК с возможностью ее последующего переноса в другие штаммы хромосомной электропорацией. На основе полученных результатов сделан вывод, что экспрессия RecE564/RecT генов в реципиентном штамме может значительно способствовать наследованию ДНК, проникшую в клетки благодаря электропорации. Можно предположить, что как разработанная комплексная стратегия в целом, так и ее отдельные процедуры могут оказаться существенно полезными для расширения спектра генно-инженерного инструментария для редактирования геномов штаммов C. glutamicum.

The post Genome engineering of the Corynebacterium glutamicum chromosome by the Extended Dual-In/Out strategy first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.

Использование крупнозернистого подхода позволило подтвердить способность НАО связываться с обоими основными отрицательно заряженными фосфолипидами бактериальных мембран, фосфатидилглицерином и кардиолипином, а также определить точную структуру комплексов НАО-липид. Флуоресцентные зонды служат эффективным инструментом для изучения локализации различных компонентов в биологических мембранах. Выявление молекулярных деталей взаимодействия зондов с мембранными фосфолипидами важно как для интерпретации экспериментальных результатов, так и для будущего дизайна липид-специфических красителей. Наше исследование показывает, что, несмотря на упрощение, используемое в крупнозернистом подходе, модельные мембранные системы, полученные этим методом, отражают реальные процессы взаимодействия мембранотропных соединений и бислоев и, таким образом, могут быть чрезвычайно полезны для разработки мембранных зондов, улучшения их свойств, чувствительности и специфичности.

The post Insights into the Formation of Intermolecular Complexes of Fluorescent Probe 10-N-nonyl Acridine Orange with Cardiolipin and Phosphatidylglycerol in Bacterial Plasma Membrane by Molecular Modeling first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.

Первоначально было показано, что на фоне функционирования гетерологичного гена собственный ген цитопламатической пирофосфатазы, ранее относящийся к незаменимой для E. coli группе жизненно важных генов, может быть успешно делетирован стандартными процедурами Рекомбиниринга, хотя и со значительным замедлением роста полученных рекомбинантных E. coli штаммов. Прямое изменение распределения метаболических потоков в рекомбинантном штамме с замененным природным геном пирофосфатазы на гетерологичный было убедительно продемонстрировано прецизионным методом ¹³С-MFA (¹³C-Metabolic Flux Analysis). Действительно, было достоверно продемонстрировано (смотри Рисунок) значительное (36%) уменьшение метаболических превращений в цикле трикарбоновых кислот (ТСА) рекомбинантного штамма, что, по-видимому, связано с отсутствием потребности в генерации большого количества прямых предшественников синтеза АТР (а именно, NADH) в ТСА из-за наличия возможности синтеза АТР другим способом в рекомбинантном штамме. Таким образом перспективность использования предложенного подхода для конструирования продуцентов энергозависимых соединений впервые экспериментально продемонстрирована.

The post H+-Translocating Membrane-Bound Pyrophosphatase from Rhodospirillum rubrum Fuels Escherichia coli Cells via an Alternative Pathway for Energy Generation first appeared on Кафедра синтетической биологии биологического факультета МГУ.